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技術(shù)文章
了解一下聚凝胺的使用步驟吧
  聚凝胺是一種多聚陽(yáng)離子聚合物,常用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以增強(qiáng)脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。Polybrene目前廣泛用于逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染,慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染,作用機(jī)理可能是通過中和細(xì)胞表面唾液酸與病毒顆粒之間的靜電排斥從而促進(jìn)吸附作用。Polybrene也是一種有名的抗肝素劑(肝素拮抗劑),常用來生產(chǎn)非特異性凝集的紅細(xì)胞。
 
  另外Polybrene也多用于蛋白測(cè)序,因?yàn)樾┝康腜olybrene在自動(dòng)測(cè)序分析可明顯改善多肽的降解現(xiàn)象。PVDF膜加入polybrene還能提高膜的親和性。
 
  實(shí)驗(yàn)1:逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(Retroviral Infection)
 
  (1)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒原液的制備:取5ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基(5%血清)加入約含單層轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄包裝細(xì)胞的100mm培養(yǎng)盤內(nèi)。孵育24h后,吸去培養(yǎng)液并用0.45μm濾器過濾。
 
  (2)待感染細(xì)胞的培養(yǎng):100mm培養(yǎng)盤內(nèi)加入10ml*培養(yǎng)基,細(xì)胞密度為5×105/盤。
 
  (3)病毒感染:細(xì)胞培養(yǎng)24h后,吸去*培養(yǎng)液。用含polybrene的2ml病毒上清 (或?qū)⒉《驹合♂尩?ml)感染細(xì)胞,polybrene的終濃度為5μg-10μg/ml。37℃孵育3-6h。
 
  (4)收集病毒顆粒:加入8ml*培養(yǎng)基。感染3天后,按照1:5的比例用選擇培養(yǎng)基裂解細(xì)胞。
 
  實(shí)驗(yàn)2:轉(zhuǎn)染
 
  (1)*生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞密度約50%;
 
  (2)孵育細(xì)胞18-24h后準(zhǔn)備DNA-培養(yǎng)基- Polybrene混合液,按如下操作制備混合液:①添加*培養(yǎng)基(60mm培養(yǎng)皿2ml,100mm培養(yǎng)皿3ml),37℃預(yù)熱;②添加10ng~10µg質(zhì)粒輕輕混勻;③加入Polybrene至終濃度為5μg-10μg/ml。輕輕混勻。以上每個(gè)成分需要按順序加入。
 
  (3)去除培養(yǎng)基,在細(xì)胞中加入DNA-培養(yǎng)基-Polybrene溶液,在37℃孵育細(xì)胞6-20h。細(xì)胞培養(yǎng)的前6h內(nèi)約每1.5h輕柔混勻。
 
  (4)去除DNA-培養(yǎng)基-Polybrene溶液。用DMSO shock solution(15%DMSO in 1X HBSS)輕輕蓋住細(xì)胞(60mm培養(yǎng)皿3ml,100mm培養(yǎng)皿4ml)。每次加入溶液時(shí)用手輕晃培養(yǎng)盤10s,使得液體均勻分布。然后37℃孵育細(xì)胞4min。
 
  (5)立即去除DMSO shock solution,用*生長(zhǎng)培養(yǎng)基輕輕清洗細(xì)胞2次。對(duì)于60mm培養(yǎng)皿每次用5ml培養(yǎng)液清洗,100mm培養(yǎng)皿每次用10ml培養(yǎng)液清洗。
 
  (6)加入*培養(yǎng)基到細(xì)胞中;
 
  (7)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化:去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基,按照1:5的比例用選擇培養(yǎng)基裂解細(xì)胞。
 
  瞬時(shí)表達(dá):去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基,加入新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。24-72h后收獲細(xì)胞。
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